Investigación en Ganac.

EVALUACIÓN DE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LAS TÉCNICAS BASADAS EN INMUNOFLUORESCENCIA E INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS DE INFLUENZA A

 

El virus de la influenza es el agente infeccioso más importante de la infancia y por lo tanto es la causa más frecuente de episodios febriles en los niños con cáncer. La mayoría de los pacientes con infecciones por influenza muestran síntomas similares a la gripe con un curso benigno, mientras que los pacientes con comorbilidades es mayo a tener un aspecto clínico grave con insuficiencia respiratoria. Los virus de influenza están relacionados con una considerable morbilidad y mortalidad en pacientes con cáncer. La causa más importante de muerte en todas las poblaciones inmunocomprometidos es la infección, los pacientes con leucemia desarrollan un 35-80% influenza, y alrededor de 43% de los pacientes que tienen leucemia desarrollan neumonía y mueren a causa de la infección, ambas infecciones están catalogadas dentro de las infecciones respiratorias agudas (IRAs).

Las infecciones respiratorias agudas (IRAs) son la principal causa de enfermedades agudas a nivel mundial y se mantienen como la causa más importante de mortalidad en lactantes, niños pequeños especialmente en niños inmunodeprimidos que es caso de los pacientes con tratamiento oncológico, contabilizándose alrededor de dos millones de muertes cada año. 

Se estima que en el Tercer Mundo ocurren entre 500 y 900 millones de casos de IRAs al año, lo que significa entre un 20 y 40% del total de hospitalizaciones y un 34% de muertes en menores de 5 años. En Europa, se reportan 2.5 millones de casos de IRAs anualmente y son responsables del 3 al 18% de los ingresos a hospitales pediátricos. En países como Canadá y EUA, este tipo de infecciones se sitúan entre las cinco primeras causas de muerte en menores de un año. Datos recientes sugieren que en EUA ocurren aproximadamente 500 millones de casos al año.

En México y en otros países subdesarrollados, las infecciones respiratorias agudas constituyen un problema de salud pública debido al impacto que tienen sobre los servicios de salud, las incapacidades laborales y escolares, además de las muertes que ocasionan cada año, principalmente en grupos de los extremos de vida. Cada año provocan elevadas tasas de morbimortalidad, ocupando dentro de las enfermedades infecciosas uno de los tres primeros lugares como causa de muerte en la población en general. Las IRAs pueden presentarse en cualquier edad aunque su frecuencia y gravedad es mayor en los menores de cinco años y en individuos inmunodeprimidos.

Las IRAs constituyen un conjunto de enfermedades producidas por múltiples agentes causales, estas pueden afectar las diferentes zonas de las vías respiratorias. Las manifestaciones clínicas son bastante evidentes y de alguna manera son constantes en cada una de ellas; los signos o síntomas usualmente están dados a fiebre alta, escalofríos, dolor intenso en el costado afectado del tórax, tos y expectoración, problemas para respirar, estridor, dolor o enrojecimiento faríngeo, otorrea, otalgia, rinorrea y obstrucción nasal. Entre los virus respiratorios más comunes encontramos virus Sincitial Respiratorio, virus Influenza A y B, virus Parainfluenza 1, 2 y 3, Adenovirus, Metapneumovirus.

Recientemente el 70% de los casos por agentes virales son causados por el virus de Influenza A, por ello es importante el diagnóstico de este patógeno. Para la identificación de Influenza A existen diferentes técnicas, entre ellas el aislamiento viral en cultivo celular, la cual posee ciertas limitaciones como el tiempo de resultados; otras técnicas rápidas basadas en Inmunofluorescencia e Inmunocromatografía varían enormemente en cuanto a sensibilidad, especificidad y valores predictivos. Es por ello que se han venido implementando técnicas basadas en biología molecular como la RT-PCR, que deja atrás estas limitaciones.

Es por esta razón que el Departamento de Investigación del Hospital Pediátrico de Sinaloa y en colaboración con la Unidad de Investigación Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Sinaloa, nos dimos a la tarea de apoyar en el diagnóstico de las infecciones respiratorias, porque en ese momento fue cuando surgió el brote virus Influenza A H1N1 en México y a la vez evaluar la sensibilidad y especificidad de kits de pruebas rápidas de diagnósticos para Inmunofluorescencia directa e Inmunocromatografía de flujo lateral para la identificación del virus de Influenza A, considerando como estándar a la RT-PCR, para ello se utilizaron muestras de lavados nasofaríngeos y se aplicaron las técnicas de Inmunofluorescencia e Inmunocromatografía, así mismo se realizó la extracción de ARN viral y se llevó a cabo la RT-PCR. Las muestras que resultaron positivas por RT-PCR, se evaluaron mediante RT-PCR en tiempo real para detectar la cepa pandémica del virus de Influenza A H1N1/09.

Se analizaron 113 muestras de niños hospitalizados con diagnóstico clínico de Neumonía recibidas durante el período de julio a diciembre del 2009, estas fueron procesadas. 

Figura 1. La detección del virus de Influenza A por RT-PCR electroforesis en gel de agarosa al 2%. Las bandas de color negro con el tamaño de 244 pb corresponden al virus de la Influenza A.

Figura 2. La detección del virus de influenza A por Inmunofluorescencia de células epiteliales del tracto respiratorio donde los virus se muestran de un color verde manzana.
Utilizando kit de IMAGENTM Influenza A and B Kit (OXOID; Cambridge, UK)

Figura 3. La detección del ensayo Inmunocromatográfico de flujo lateral resultando positivo observar las bandas color azul en el dispositivo de prueba.
Utilizado kit de Xpect® Flu A&B (Remel; Lenexa, KS, USA).

ArtMEdicina

Resultados: Sensibilidad, Especificidad y Valores Predictivos

De las 113 muestras se identificaron 58 muestras positivas para virus Influenza A mediante RT-PCR. 53 mediante Inmunofluorescencia y 44 con Inmunocromatografía. Los resultados pueden ser apreciados en el Cuadro 1.

La frecuencia del virus de Influenza A de 51.33%; de estos casos positivos en el 46.55% se encontró a la cepa pandémica del virus. En agosto se registró el mayor número de casos.
Figura 4., positivos tanto de la Influenza estacional circulante como de la cepa pandémica.

El grupo de edad más afectado fue el de 1 a 3 años (27.27%).
Figura 4. Frecuencia de muestras positivas con los tres métodos de diagnóstico.

Los virus de Influenza se encuentran asociados con las complicaciones más severas de las infecciones respiratorias como lo son la bronquiolitis y la neumonía, no obstante las infecciones provocadas por Influenza suelen confundirse con aquellas provocadas por el virus Sincitial Respiratorio; es por esta razón que el diagnóstico oportuno de la infección debida a Influenza A tiene impacto sobre la toma de decisiones en el cuidado del paciente, incluyendo el control de la infección, el uso de terapia antiviral específica y otros aspectos de manejo clínico. Además de que para adultos y niños hospitalizados, un diagnóstico rápido reduce enormemente la estancia hospitalaria y el uso de antibióticos, de la misma manera se evitan las complicaciones por neumonía bacteriana secundaria o mixta.

El virus de Influenza A tiene la peculiaridad de ocasionar epidemias de manera estacional en la mayor parte de los países, los patrones varían dependiendo de la región del mundo; en países con clima templado es más frecuente en los meses fríos del año, al finalizar otoño y con un pico a mediados de invierno, infectando alrededor del 5 al 15% de la población cada temporada; mientras que en países con climas tropicales y subtropicales puede permanecer a lo largo de todo el año, aunque se ha demostrado en países como México y Costa Rica que el virus comienza a presentarse al inicio de la temporada.

El presente estudio permitió conocer la frecuencia del virus de Influenza A dentro de la población infantil del estado de Sinaloa, durante el período de julio a diciembre de 2009; así mismo se identificó la presencia del virus de Influenza pandémico presente durante el 2009 y parte del 2010, en aquellas muestras que resultaron positivas mediante RT-PCR. No obstante se requeriría en futuros estudios la subtipificación del virus en aquellas muestras que resultaron positivas mediante RT-PCR y que no correspondieron al nuevo subtipo del virus. Así mismo, podría buscarse en las muestras clínicas que resultaron positivas para Influenza A, la mutación del virus que le confiere resistencia al tratamiento con Tamiflu, ya que algunos de los pacientes de los que se obtuvieron las muestreas no respondieron al tratamiento y fallecieron; aunque si bien es cierto que en estos pacientes que fallecieron su padecimiento primario correspondía a leucemia, su deterioro y defunción al parecer estuvo vinculada al virus de la Influenza, por ello es probable que se puedan encontrar aislados de virus resistentes al tratamiento.

Es necesario evaluar las muestras para conocer la frecuencia de otros virus respiratorios de importancia en población infantil como el virus Sincitial Respiratorio o el Metapneumovirus; ya que no se debe descartar que estos virus estuvieran ocasionando coinfecciones en algunas de las muestras de los pacientes analizados.

Por otra parte, aunque si bien se evaluó la sensibilidad, especificidad y valores predictivos de pruebas rápidas de diagnóstico basadas en Inmunofluorescencia e Inmunocromatografía considerando la RT-PCR como criterio de referencia, se podrían realizar los ensayos de aislamiento en cultivo celular para contrastar los resultados. Así mismo convendría evaluar estos valores para pruebas rápidas existentes en el mercado para otros virus respiratorios de importancia.

Agradecimientos:

 

Se necesitó de un gran apoyo ya que el costo de este proyecto fue muy elevado, nos gustaría agradecer al Departamento de Investigación del Hospital Pediátrico de Sinaloa, la Unidad de Investigación Facultad de Medicina (UAS) y UCIP del IMSS por su apoyo durante el estudio. El proyecto fue financiado principalmente por una beca de CONACYT-Gobierno del Estado de Sinaloa (Sin-2008-C01-100755), CECyT (Convocatoria 2009), Grupo Amigos Afectados de Cáncer (GANAC-IAP), la Carrera Contra el Cáncer Fundación, el consulado de Canadá en el Estado de Sinaloa, al Instituto Anglo Moderno de Mazatlán y a Biotrónica, S.A. de C.V., por la donación de algunos kits usados durante el desarrollo de este proyecto.

Este trabajo fue publicado en la revista científica THE JOURNAL OF INFECTION IN DEVELOPING COUNTRIES y es de libre acceso donde se puede descargar la versiónoriginal